皮膚是人體最大的器官，作為人體最外層的保護(hù)屏障，極易受到外界環(huán)境影響，同時(shí)也是衰老跡象最明顯的部位。隨著年齡增長，人體抗氧化系統(tǒng)的功能逐漸下降。此外，當(dāng)皮膚暴露于電離輻射、紫外線輻射，或外來污染物質(zhì)時(shí)，會(huì)引起大量活性氧自由基生成，遠(yuǎn)超機(jī)體自身氧化降解系統(tǒng)的處理能力，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和機(jī)體損傷[1]。盡管年齡的增長是自然規(guī)律，無法逆轉(zhuǎn)，但我們卻可以通過多種方式來延緩皮膚的衰老進(jìn)程。其中，抗衰老化妝品以其便捷性和顯著效果，成為全球范圍內(nèi)備受矚目的研究熱點(diǎn)。這些產(chǎn)品通過外用的方式，為肌膚提供必要的滋養(yǎng)與保護(hù)，幫助人們有效對抗歲月痕跡，保持肌膚年輕態(tài)與活力。
自由基作為一種重要的“衰老因子”，成為了抗衰化妝品領(lǐng)域的重點(diǎn)關(guān)注對象。
圖1 自由基破壞細(xì)胞（圖片來源網(wǎng)絡(luò)）
氧化還原反應(yīng)是生命活動(dòng)的基本過程之一，是生物體內(nèi)能量代謝的主要途徑。生命體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)與氧自由基的生成和清除密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞暴露在高氧濃度的環(huán)境下時(shí)，會(huì)產(chǎn)生氧自由基，這些自由基可以造成細(xì)胞膜損傷、DNA氧化和其他細(xì)胞成分的氧化破壞。自由基，化學(xué)上也稱為“游離基”，是指化合物的分子在光熱等外界條件下，共價(jià)鍵發(fā)生均裂而形成的具有不成對電子的原子或基團(tuán)。活性氧（ROS）是自由基的代表，ROS的積聚和由此引起的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)和加速衰老過程，包括皮膚衰老[2]。活性氧（ROS）是線粒體有氧代謝電子傳遞鏈的副產(chǎn)物，積累可引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)核酸和細(xì)胞器的損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老的發(fā)生。除遺傳因素外，ROS是內(nèi)源性衰老的主要原因。
圖2 ROS導(dǎo)致皮膚內(nèi)源性衰老（圖片來源網(wǎng)絡(luò)）
雖然自由基常被視為對機(jī)體有害的分子，但它們在生物體內(nèi)也扮演著一些重要的正面角色。在某些生物過程中，自由基作為信號分子參與細(xì)胞間信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生理功能，幫助機(jī)體抵抗外來病原體。然而，當(dāng)自由基數(shù)量過多或機(jī)體抗氧化能力不足時(shí)，它們會(huì)對機(jī)體造成嚴(yán)重的負(fù)面影響，如造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能損傷、攻擊DNA分子導(dǎo)致復(fù)制錯(cuò)誤，引發(fā)細(xì)胞突變和癌癥等；損傷蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞正常代謝，加速細(xì)胞老化，引發(fā)皮膚老化、關(guān)節(jié)炎等老年疾病；促進(jìn)炎癥因子釋放，引發(fā)慢性炎癥；損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，增加心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。
自由基導(dǎo)致皮膚老化的機(jī)制雖然錯(cuò)綜復(fù)雜，但引發(fā)的直觀現(xiàn)象與最終結(jié)果卻十分明確：皮膚部分結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生衰老性變化，這些變化與自由基的損害作用緊密相連。具體來說，皮膚彈性的減弱、膠原的變性、皺紋的形成等，均顯著受到自由基攻擊的影響。
綜上所述，自由基在生物體內(nèi)具有雙重作用。為保持機(jī)體健康，需要保持自由基與抗氧化劑之間的平衡，以減少自由基對機(jī)體的負(fù)面影響。那么，機(jī)體中的自由基究竟從何而來呢？
通過吸入的氧氣留存在機(jī)體的自由基含量，在正常情況下占人體每日吸入氧氣的1%~3%。這些氧氣在機(jī)體內(nèi)經(jīng)過一系列生化反應(yīng)，部分轉(zhuǎn)化為自由基，主要是氧自由基。此外，外界環(huán)境因素誘導(dǎo)也會(huì)導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生，如光熱、輻射、大氣污染、化學(xué)物質(zhì)、食品添加劑等毒素影響或侵入人體，累積在體內(nèi)的活性氧自由基會(huì)加速皮膚衰老。
圖3 自由基主要來源（圖片來源網(wǎng)絡(luò)）
聚焦于標(biāo)題所提的“抗氧化”概念，其核心在于清除體內(nèi)過量的自由基，或通過間接方式減少易產(chǎn)生自由基的物質(zhì)，以此來發(fā)揮顯著的抗衰老效果。
在評估抗氧化效果時(shí)，我們可以依據(jù)生化分析、細(xì)胞及皮膚模型多個(gè)層面進(jìn)行綜合考量。
DPPH / PTIO法檢測待測物自由基清除能力
抗氧化是抗氧化自由基的簡稱，DPPH的氮原子孤對電子/PITO的氧原子孤對電子可與自由基清除劑提供一個(gè)電子配對，自身紫紅色/藍(lán)紫色變淺，吸光度變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系。因此可通過吸光度變化進(jìn)行定量分析，從而評價(jià)樣品的自由基清除能力。
注：隨著樣品濃度增加，DPPH和PTIO自由基清除率升高，樣品具有良好的抗氧化能力。
參考標(biāo)準(zhǔn)：T/SHRH 006-2018 化妝品-自由基（DPPH）清除實(shí)驗(yàn)方法
圖4 DPPH / PTIO法檢測自由基清除能力（圖片來源科新生物）
基于角質(zhì)形成細(xì)胞的抗氧化能力檢測
DCFH-DA熒光探針法是一種用于檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的方法。該探針本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成有熒光的DCF。通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀等設(shè)備檢測DCF的熒光信號強(qiáng)度，可以分析細(xì)胞活性氧的水平。
圖5 熒光探針作用示意圖（圖片來源網(wǎng)絡(luò)）
細(xì)胞內(nèi)活性氧將無熒光的DCFH氧化為有熒光的DCF，根據(jù)DCF的熒光強(qiáng)度判斷細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。
圖6 熒光探針作用原理圖（圖片來源網(wǎng)絡(luò)）
采用DCFH-DA熒光探針法測定ROS含量，樣品組綠色熒光強(qiáng)度明顯下降，ROS清除能力更強(qiáng)，表明樣品具有良好的抗氧化能力。
Control Model Sample
圖7 ROS含量（圖片來源科新生物）
基于3D表皮模型的抗氧化能力檢測
3D表皮模型憑借其高度模擬人體皮膚的復(fù)層化組織結(jié)構(gòu)，以及展現(xiàn)出的相近生理與代謝功能特性，已成為化妝品功效評價(jià)領(lǐng)域中的一項(xiàng)卓越替代檢測手段。在利用3D表皮模型進(jìn)行抗氧化能力評估時(shí)，我們同樣采用了DCFH熒光探針技術(shù)來精確測定自由基的清除效能。通過拍照及熒光強(qiáng)度的定量分析，從而科學(xué)、準(zhǔn)確地評價(jià)待測物質(zhì)的抗氧化性能。
衰老過程、眾多慢性疾病乃至癌癥的發(fā)生，均與自由基過量密切相關(guān)，這使得抗氧化成為當(dāng)今消費(fèi)者日益增長的核心需求之一，同時(shí)也是研發(fā)領(lǐng)域重點(diǎn)攻克的方向。在抗衰老功效檢測體系中，對抗氧化能力的科學(xué)評價(jià)占據(jù)著舉足輕重的地位，它不僅為企業(yè)的研發(fā)創(chuàng)新提供了堅(jiān)實(shí)的支撐點(diǎn)，還成為驗(yàn)證產(chǎn)品有效性的重要依據(jù)。
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- T∕SHRH 006-2018 化妝品-自由基（DPPH）清除實(shí)驗(yàn)方法
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