皮膚衰老的指標(biāo)有哪些
皮膚衰老的特征標(biāo)志物：細(xì)胞形態(tài)變大，扁平，細(xì)胞核體積增大；衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）酶活性增強(qiáng)；p53、p21和p16表達(dá)上調(diào)；Lamin B1下調(diào)；ATM表達(dá)下調(diào)；穩(wěn)定的DNA損傷反應(yīng)（DDR）；HMGB1核移位至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外液；衰老相關(guān)分泌表型（SASP）的分泌，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和炎癥因子（IL-1, IL-6, IL-8等）；以及脂褐質(zhì)和ROS的大量積累等……
衰老相關(guān)分泌表型（SASP）是衰老細(xì)胞分泌的一種促炎癥表型。SASP包括一系列細(xì)胞因子和生長因子，如IL-1、IL-6、IL-8、TGF-β、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等。這些因子通過與免疫系統(tǒng)協(xié)作，改善細(xì)胞微環(huán)境的同時，影響鄰近細(xì)胞的增殖與分化。多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路參與SASP的調(diào)控。例如，NF-κB、p53、p21、p16和Rb等單獨(dú)或協(xié)同激活SASP；ATM、CHK2、ATR、GATA4和聚合酶1（PARP1）等DNA損傷反應(yīng)（DDR）蛋白也參與SASP的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。
圖1 皮膚衰老相關(guān)影響因素及作用機(jī)制[1,2]
圖2 皮膚衰老相關(guān)生物指標(biāo)[3]
1.基于人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的抗衰功效測定
角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)量占表皮細(xì)胞的80%以上，是表皮的主要構(gòu)成細(xì)胞。在向角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中，角質(zhì)形成細(xì)胞可分為四個層次，分別是基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層。表皮中紫外線敏感的靶細(xì)胞主要是角質(zhì)形成細(xì)胞。近年來，眾多研究表明，人角質(zhì)形成細(xì)胞在光老化的起始與演進(jìn)過程中扮演著舉足輕重的角色，并且在加劇炎癥反應(yīng)方面表現(xiàn)得尤為顯著。
紫外線照射可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞釋放超量自由基。在磷脂酶A2作用下，自由基誘發(fā)花生四烯酸的產(chǎn)生，花生四烯酸在環(huán)氧化酶與脂質(zhì)環(huán)氧化酶作用下，合成初級炎癥因子，如白三烯（LTB4）和前列腺素E2（PGE2）。自由基還通過上調(diào)核轉(zhuǎn)錄酶NF-kB，促進(jìn)DNA表達(dá)更多的次級炎癥因子，如腫瘤壞死因子TNF-α和白介素IL-1。此外，紫外線照射還可以激活細(xì)胞內(nèi)NF-kB、MAPK信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)IL-6、COX-2等促炎因子表達(dá)。
炎癥因子（IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1 α等）
圖3 不同處理?xiàng)l件下炎癥因子含量變化
人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞來源于非黑色素瘤的人體正常表皮組織，可以在培養(yǎng)條件下無限期地進(jìn)行增殖，不會發(fā)生自然凋亡。目前，HaCaT細(xì)胞已廣泛應(yīng)用于美白保濕、抗衰、劃痕實(shí)驗(yàn)等多項(xiàng)體外功效檢測項(xiàng)目中。
2.基于人皮膚表皮干細(xì)胞的抗衰功效測定
表皮干細(xì)胞（Epidermal stem cells，EpiSCs）位于表皮基底層，通過整合素附著在下方基底膜上，具有自我更新的能力，并分化為各層皮膚組織。表皮一直處于不斷增殖、分化和凋亡的狀態(tài)。中波紫外線（UVB）的誘變性很強(qiáng)，與DNA相互作用產(chǎn)生胸腺嘧啶二聚體光產(chǎn)物，導(dǎo)致DNA損傷；UVB穿透性強(qiáng)，可滲透到表皮基底層。
圖4 表皮干細(xì)胞及紫外線對其影響
表皮干細(xì)胞是各種表皮細(xì)胞的祖先細(xì)胞，具有雙向分化的能力。它們主要存在于表皮基底層中，是維持皮膚穩(wěn)態(tài)和修復(fù)機(jī)制的關(guān)鍵。表皮干細(xì)胞的干性表達(dá)主要體現(xiàn)在其自我更新和多向分化潛能上，這使得它們能夠不斷產(chǎn)生新的表皮細(xì)胞，維持皮膚完整性和功能性。表皮干細(xì)胞的干性表達(dá)對皮膚抗衰具有重要作用。它們通過促進(jìn)皮膚修復(fù)和再生、維持皮膚彈性和緊致度、調(diào)節(jié)皮膚炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)功能以及促進(jìn)皮膚細(xì)胞代謝等方式來減緩皮膚衰老。因此，保護(hù)和促進(jìn)表皮干細(xì)胞的干性表達(dá)對于維持皮膚健康和年輕態(tài)具有重要意義。
圖5 細(xì)胞干性表達(dá)
3.基于人皮膚成纖維細(xì)胞的抗衰功效測定
人皮膚成纖維細(xì)胞（Human skin fibroblasts，HSF）主要位于真皮層，在乳頭層和網(wǎng)狀層中均有分布。成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來。這些細(xì)胞具有合成和分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力，包括膠原蛋白、彈性蛋白、透明質(zhì)酸和糖蛋白等。HSF的減少是皺紋產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。
當(dāng)皮膚受到損傷時，表皮干細(xì)胞會被激活并遷移到傷口處，分化成新的表皮細(xì)胞以修復(fù)受損組織；通過分泌生長因子和細(xì)胞因子等活性物質(zhì)，刺激皮膚成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白和彈性蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白，使皮膚更加緊致光滑；通過分泌消炎因子等活性物質(zhì)來減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生和持續(xù)，保護(hù)皮膚免受外界損傷和刺激，從而減緩皮膚衰老；促進(jìn)皮膚細(xì)胞代謝，包括細(xì)胞分裂、增殖和分化等。
研究人員已明確指出，自然老化過程中皮膚膠原的減少，歸因于成纖維細(xì)胞合成膠原的能力減弱，同時伴隨基質(zhì)金屬蛋白酶（特別是MMP-1和MMP-2）分泌增多。相比之下，光老化導(dǎo)致的皮膚膠原減少，則主要由于成纖維細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶顯著增加，而膠原合成的降低并不如前者顯著。由此可見，在自然老化和光老化這兩種皮膚老化過程中，成纖維細(xì)胞的膠原代謝機(jī)制存在著一定的差異。
圖7 Collagen I and Elastin含量
圖8 Collagen I and Elastin表達(dá)
4.其他衰老相關(guān)生物指標(biāo)的測定
衰老細(xì)胞通常體積增大，溶酶體衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）酶活性增高。β-半乳糖苷酶在正常人體細(xì)胞中主要表達(dá)在溶酶體，最適pH為4-4.5；而在衰老細(xì)胞中，SA-β-gal大量積累，最適pH偏移至6，因此給予β-gal作用底物X-gal和pH6的環(huán)境，衰老細(xì)胞可在β-gal的作用下，將底物轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色，在普通光學(xué)顯微鏡下可觀測。
β-半乳糖苷酶染色圖
圖9 β-半乳糖苷酶染色圖
線粒體功能障礙可能是引發(fā)衰老的始動因素之一，除了線粒體膜電位下降外，還包括線粒體質(zhì)量、形態(tài)的異常變化。這些變化會導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝受損、細(xì)胞功能障礙甚至死亡，從而加速細(xì)胞衰老。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。可以檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)（matrix）中，形成聚合物（J-aggregates），可產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體（monomer），可產(chǎn)生綠色熒光。
圖10線粒體膜電位圖
超過80%的面部老化由紫外照射所致，同時皮膚衰老阻礙了自噬的發(fā)生。自噬是衰老過程的關(guān)鍵參與者，增加自噬可延緩衰老。采用MDC作為熒光探針來標(biāo)記和觀察細(xì)胞自噬體。
圖11 細(xì)胞自噬通量
丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一。在細(xì)胞衰老過程中，由于活性氧自由基（ROS）的累積和抗氧化機(jī)制的失衡，會導(dǎo)致膜脂發(fā)生過氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生丙二醛。這種過氧化反應(yīng)會損害生物膜及其功能，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，進(jìn)而加速細(xì)胞衰老。TBA法測定MDA含量，MDA在酸性和高溫條件下，與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成棕紅色三甲川（3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二酮），532 nm處比色測定樣品中過氧化脂質(zhì)含量。
圖12 細(xì)胞內(nèi)MDA含量
細(xì)胞衰老最基本的特征之一，就是發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞周期停滯，可能是由有害刺激或異常增殖引起的警報反應(yīng)。隨著細(xì)胞衰老進(jìn)程的推進(jìn)，細(xì)胞周期相關(guān)因子p16、p21、p53表達(dá)上調(diào)，并在衰老細(xì)胞中積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。通過qPCR或免疫熒光手段檢測p16、p21、p53表達(dá)情況，以評價樣品的抗光老化作用。
圖13 細(xì)胞衰老相關(guān)基因表達(dá)（p16, p21, p53）
5.抗氧化功效評價
抗氧化是抗氧化自由基的簡稱，DPPH的氮原子孤對電子/PITO的氧原子孤對電子可與自由基清除劑提供一個電子配對，自身紫紅色/藍(lán)紫色變淺，吸光度變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系。因此可通過吸光度變化進(jìn)行定量分析，從而評價樣品的自由基清除能力。
DPPH / PTIO自由基清除實(shí)驗(yàn)(生化反應(yīng))
圖14 DPPH / PTIO自由基清除實(shí)驗(yàn)（生化反應(yīng)）
機(jī)體新陳代謝及外界環(huán)境刺激（如UV、環(huán)境污染、化學(xué)試劑等）可能導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生，自由基具有較強(qiáng)的氧化能力，當(dāng)自身疾病或外界刺激過強(qiáng)導(dǎo)致自由基產(chǎn)生增加，而自身抗氧化能力不足以完全消除氧化物，過量自由基導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，以及機(jī)體組織損傷和器官病變。因此，采用UVB刺激人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT），通過檢測樣品作用后HaCaT細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量變化，評價樣品的抗氧化功效。
圖15 ROS含量（DCFH-DA法）
6.抗糖基化功效評價
糖基化終產(chǎn)物（AGEs）是蛋白質(zhì)、脂肪和糖類結(jié)合在一起產(chǎn)生的非酶促反應(yīng)終產(chǎn)物。
它們會在人體內(nèi)積累，并逐漸破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。AGEs的積累會導(dǎo)致細(xì)胞膜流動性降低，影響細(xì)胞的物質(zhì)交流和信號傳遞。隨著AGEs的積累，細(xì)胞的功能逐漸喪失。這表現(xiàn)為細(xì)胞增殖與分化能力下降，代謝速率減慢，以及對外界刺激的敏感性降低等。細(xì)胞功能的喪失會導(dǎo)致組織器官功能下降，進(jìn)而引發(fā)各種疾病和衰老現(xiàn)象。
牛血清白蛋白的游離氨基可與還原糖（果糖）的醛基經(jīng)過縮合、重排、裂解、氧化修飾反應(yīng)生成帶有熒光吸收的AGEs，AGEs含量變化一定程度反應(yīng)待測樣品的抗糖基化活性。CML是由賴氨酸以GO為中間體產(chǎn)生的一種非熒光性、非交聯(lián)性AGEs，能引發(fā)炎癥和衰老，導(dǎo)致皮膚損傷，可通過ELISA法對其含量進(jìn)行測定。
圖16 AGEs抑制率和CML含量（ELISA）
上述方法系統(tǒng)性闡述了利用體外細(xì)胞培養(yǎng)及模型構(gòu)建技術(shù)來評估抗衰老效果的評價體系。其核心目的在于，針對多樣化的功效評估與測試需求，通過體外培養(yǎng)特定類型的細(xì)胞或構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，并運(yùn)用目標(biāo)活性成分進(jìn)行刺激處理。隨后，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化、毒性反應(yīng)及增殖能力等關(guān)鍵指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，如分析特定基因通路及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，全面評估原料或成品在抗衰老方面的實(shí)際功效。
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